Στο Β.Α. άκρο του κάστρου της Ακρόπολης βρίσκεται ο πανέμορφος, βυζαντινός ναός του Αγίου Νικολάου. Κτίσθηκε σύμφωνα με τις ενδείξεις Πρακτικού του 1339-1342 μ.Χ. αλλά και της μορφής τοιχογραφίας του ναού πριν από τη Σερβική κατοχή και συγκεκριμένα κατά το πρώτο μισό του 14ου αιώνα (εποχή Παλαιολόγων).

    Ο αρχιτεκτονικός τύπος του μνημείου είναι τρίγχοκος μονόκλιτος με τρούλο. Στην ανατολική της αψίδας βρίσκεται είσοδος κρύπτης, στην οποία κατεβαίνει κανείς με μικρή σκάλα. Η κρύπτη αυτή είχε κοιμητικό σκοπό, ήταν δηλαδή ο τόπος ταφής των στρατιωτικών της φρουράς του κάστρου, που φονεύονταν ή πέθαιναν μέσα σε αυτό από ασθένεια ή άλλα αίτια. Τον κοιμητηριακό χαρακτήρα της κρύπτης του Αγίου Νικολάου βεβαιώνουν τα λείψανα τάφων και ανθρώπινων οστών που βρέθηκαν σε αυτήν. Μέχρι το 1926 διατηρούνταν στο εσωτερικό του ναού αρκετά λείψανα τοιχογραφιών και λείψανα κοσμημάτων με τη συνήθη τεχνοτροπία και θέματα της εποχής των Παλαιολόγων.Αναστηλώθηκε και ανανεώθηκε το 1937 με την πρωτοβουλία τριών Σερραίων κυριών. Μέχρι το 1926 διατηρούνταν στο εσωτερικό του ναού αρκετά λείψανα τοιχογραφιών, όπως: παράσταση της Θείας Μετάληψης και Μετάδοσης των Αποστόλων, ο Ιησούς ξαπλωμένος ως παιδί γυμνό (Αμνός), ΄Αγγελος που κρατούσε λειτουργικό ριπίδιο, Προτομή της Θεοτόκου δεομένης, η εικόνα του Αγίου Μοδέστου, ο οποίος με το δεξί του χέρι ευλογούσε και με το αριστερό του κρατούσε το Ευαγγέλιο.

    Την παλαιότερη πληροφορία για τον Ναό την βρίσκουμε σε απόσπασμα Πρακτικού (1339-1342 μ.χ.) όπου γίνεται μνεία περί «πύργου του Αγίου Νικολάου». Προφανώς πρόκειται περί του πύργου της Ακρόπολης, που υψωνόταν κοντά στο ανό του Αγίου Νικολάου, απ΄όπου πήρε και την ονομασία του. Δεύτερη μνεία για το ναό έχουμε στο οδοιπορικό του Τούρκου περιηγητή Εβλιά Τσελεμπή (17ος αιώνας), ο οποίος αναφέρει ότι στο έρημο τότε κάστρο είδε ένα κατεστραμμένο ναό. Πρόκειται ασφαλώς για τον ναό του Αγίου Νικολάου, του οποίου η ερείπωση είχε αρχίσει κατά την εποχή εκείνη. Στη δυτική πλευρά του τετραγώνου ήταν προσκεκολλημένος άλλος στενός επιμήκης χώρος, ο οποίος αποτελούσε τον νάρθηκα.

    Ο Γάλλος καπουτσίνος Robert de Dreux, όταν πέρασε από την πόλη των Σερρών το 1669, αναφέρει ότι είδε επί του κάστρου δυο ερειπωμένα παρεκκλήσια. Το ένα απ΄αυτά πιθανότατα ήταν ο ναΐσκος του Αγίου Νικολάου.

    Ο Γάλλος πρόξενος και περιηγητής Cousinery κατά την δεύτερή του επίσκεψη στην πόλη των Σερρών (1814) σημειώνει ότι είδε μέσα στο κάστρο τα ερείπια του Αγίου Νικολάου, στον οποίο μάλιστα εσώζοντο και αρκετά λείψανα τοιχογραφιών.

    Το 1956 εικονογραφήθηκε από δύο αξιόλογους ζωγράφους τον Γ. Παραλή και Δ. Κεντάκα, που περιορίστηκαν μόνό σε αντιγραφές. (ΦΕΚ 262 /25, 112 Β΄ /84).